Comparar dos parcelas sin engañarse: diseño mínimo de un ensayo

Réplicas y pseudorreplicación

El error más frecuente en los ensayos de microbioma agrícola tiene nombre desde 1984. Hurlbert lo llamó pseudorreplicación: aplicar el tratamiento una sola vez y después tomar varias muestras de ese único sitio, tratándolas en el análisis como si fueran réplicas independientes. No lo son. Con una parcela tratada y una testigo, el número de réplicas del experimento es uno, por muchas muestras que se saquen de cada una.

La distinción, en la práctica:

• Réplica verdadera. Varias unidades experimentales —parcelas, bloques, filas— que reciben el tratamiento de forma independiente. Permiten estimar cuánta variación hay entre unidades tratadas, que es contra lo que se compara el efecto.

• Submuestra. Varios puntos dentro de la misma unidad. Sirven para caracterizar bien esa unidad —y conviene tomarlas, y mezclarlas en una muestra compuesta— pero no aumentan el número de réplicas.

En ecología microbiana el recordatorio se volvió casi un género literario: Prosser tituló su llamada de atención de 2010 Replicate or lie, «replica o miente». Es duro y es exacto: sin réplicas no hay forma de distinguir el efecto del ruido, así que cualquier conclusión que se publique es una afirmación sin respaldo.

Esto es, antes que nada, una decisión de presupuesto. Con un coste orientativo de 70 a 270 € por muestra según técnica y volumen, el número de muestras no es infinito, y hay que repartirlo. La regla práctica: antes de añadir una tercera profundidad o un cuarto momento de muestreo, gasta el dinero en réplicas. Un diseño de cinco tratadas y cinco testigo a una sola profundidad contesta; dos y dos a tres profundidades no contesta nada, con el mismo gasto.

Testigo: dónde ponerlo

El testigo tiene que compartir con el tratamiento todo menos el tratamiento. En una finca real eso significa:

• Emparejado, no al otro extremo de la finca. El suelo cambia de textura, pH y profundidad útil en metros. Un testigo lejano mide el mapa de la finca, no el producto. Lo que funciona es alternar: tratada, testigo, tratada, testigo.

• Misma agua, mismo abonado, misma variedad y mismo portainjerto. Si el tratado va en el sector de riego nuevo, el ensayo compara sectores de riego.

• Con separación suficiente. Si el producto se aplica por fertirrigación, el testigo no puede estar en la misma línea de goteo aguas abajo.

• Decidido antes, no después. Elegir el testigo al ver los resultados es elegir la conclusión.

Knight y colaboradores (2018) recopilaron las buenas prácticas de análisis de microbiomas, y conviene leerlas antes de secuenciar y no después: ningún método de análisis arregla un diseño confundido.

Dos tiempos, no uno

Un muestreo único después del tratamiento no puede separar dos explicaciones: que el producto haya cambiado el suelo, o que esas parcelas ya fueran distintas antes. Con un t0 antes de aplicar el ensayo deja de comparar parcelas y pasa a comparar cambios, que es lo que se quiere saber.

Tres consecuencias de diseño que se derivan de ahí:

• El t0 se toma también en las testigo. Un t0 solo en las tratadas no sirve: hace falta saber cuánto se mueve el suelo por sí solo en ese intervalo.

• El intervalo hasta el t1 lo marca la biología, no el calendario comercial. La respuesta microbiana a una aplicación es de semanas; la respuesta a un cambio de manejo, de campañas.

• Las dos tomas deben ser idénticas en método: misma profundidad, misma posición respecto a la raíz, misma hora, mismo transporte. El protocolo está en el post de muestreo.

Diversidad alfa y beta: qué contesta cada una

Son dos preguntas distintas y se confunden a diario en los informes:

• Alfa. Cuánta variedad hay dentro de una muestra: riqueza, Shannon. Contesta «¿este suelo es más diverso que aquel?». Es la variable que más se publica y la que menos se mueve con el manejo a corto plazo; en el post de cubiertas se ve bien: +27 % de abundancia frente a +2,5 % de diversidad.

• Beta. Cuánto se parecen las muestras entre sí. Contesta «¿las tratadas se separan de las testigo?», que es la pregunta del ensayo. Se ve en una ordenación y se contrasta con PERMANOVA, el método no paramétrico que Anderson (2001) propuso justo para esto: comparar grupos a partir de una matriz de distancias, sin asumir normalidad.

Dos precauciones sobre la lectura de esas figuras. La primera: un gráfico de ordenación donde los puntos se separan no demuestra nada por sí mismo —hay que contrastar el agrupamiento—, y con pocas réplicas casi cualquier nube parece agrupada. La segunda, de fondo: Gloor, Macklaim, Pawlowsky-Glahn y Egozcue (2017) recordaron que estos datos son composicionales, es decir, proporciones que suman uno. Lo que se mide es abundancia relativa en la muestra, no abundancia absoluta en el suelo, y eso obliga a elegir métodos pensados para ese tipo de dato. Cuando un taxón sube de proporción, puede ser porque creció él o porque bajó otro.

Análisis diferencial y falsos positivos

Llega el momento de la tabla de «taxones significativamente aumentados». Es la parte más vendible del informe y la más frágil, y hay un trabajo que conviene conocer antes de apoyar una decisión en ella. Nearing y colaboradores (2022) aplicaron 14 métodos de análisis diferencial a 38 conjuntos de datos de 16S con dos grupos de muestras. Resultados:

• Los métodos identificaban números y conjuntos de variantes significativas drásticamente distintos, y el resultado dependía además del preprocesado.

• En muchos métodos, el número de taxones detectados correlacionaba con características del propio conjunto de datos —tamaño de muestra, profundidad de secuenciación y tamaño del efecto—, no solo con la biología.

• ALDEx2 y ANCOM-II dieron los resultados más consistentes entre estudios y los que mejor coincidían con la intersección de los demás enfoques.

• Su recomendación es un enfoque de consenso: varios métodos y quedarse con lo que sobrevive a todos.

La normalización previa pesa parecido. Weiss y colaboradores (2017) evaluaron normalizaciones y métodos de abundancia diferencial y encontraron que rarefacar agrupaba las muestras por su origen biológico con más claridad que otras técnicas en las métricas de ordenación basadas en presencia o ausencia, mientras que otras normalizaciones pueden ser vulnerables a artefactos por el tamaño de la librería. Sobre falsos positivos, su simulación indicaba que la tasa de descubrimientos falsos de muchos métodos no aumenta por rarefacar, aunque sí se pierde sensibilidad al tirar parte de los datos disponibles.

Y la precaución elemental: cuando se contrastan miles de taxones a la vez, por puro azar unos cuantos salen significativos. La corrección por comparaciones múltiples —controlar la tasa de falsos descubrimientos, en la línea de Benjamini y Hochberg (1995)— no es un refinamiento estadístico opcional. Un informe que presente «p < 0,05» sobre 3.000 taxones sin corregir está presentando ruido con decimales.

El diseño del caso de cítricos, paso a paso

El ensayo de cítricos que figura en nuestra página de inicio es un ejemplo de diseño mínimo que cumple lo anterior. Sus tres decisiones:

1. Tratado (5) frente a testigo (5). Cinco unidades por brazo, no una con cinco submuestras. Es el mínimo con el que la comparación aguanta un contraste.

2. Dos tiempos: antes y después del tratamiento. Con t0 en los dos brazos, el ensayo mide cambios y no diferencias de partida.

3. Suelo, próximo al bulbo húmedo. La posición se fija de antemano y es la misma en los diez puntos. En riego localizado, el bulbo húmedo es donde está la raíz activa y donde llega el producto; a un metro de ahí se mide otra cosa.

Lo que ese diseño permitió concluir está publicado en términos cualitativos: el bioestimulante favorecía microorganismos fijadores de nitrógeno y de solubilización de fósforo, el microbioma correlacionaba con el análisis foliar, y de ahí salió un ajuste de dosis de fertilizantes y de selección de productos. Las magnitudes son del cliente y no se publican aquí; lo que se puede llevar a otro ensayo es la forma, que es lo que estaba en juego en este post.

Un detalle que conviene subrayar: la correlación con el análisis foliar es lo que convierte un perfil microbiano en una decisión. El microbioma por sí solo describe una comunidad; cruzado con una variable agronómica que el técnico ya mide y ya entiende, empieza a sostener un cambio de programa.

Qué hacemos en AIMA Agro

Cuando el ensayo es para validar un producto, el diseño se cierra antes de aceptar las muestras: cuántas unidades por brazo, dónde va el testigo, qué momentos, qué profundidad y qué técnica para la pregunta. En análisis de cultivos esa conversación es parte del servicio, y no es cortesía: un ensayo mal diseñado nos cuesta a los dos, porque el informe no podrá decir lo que el cliente necesita oír ni lo contrario.

Para empresas de bioinsumos y departamentos de I+D hay dos cosas más. Una, que el análisis diferencial se reporta con corrección por comparaciones múltiples y declarando el método, no como una lista de ganadores. Dos, que el informe puede salir en marca blanca para que el distribuidor lo entregue como propio. Lo que no hacemos es firmar una conclusión que el diseño no soporta.

Si lo que hay encima de la mesa es un bioestimulante que no acaba de demostrarse, merece la pena leer antes por qué fallan tantas inoculaciones: a veces el problema no es el ensayo, es que el producto no tenía dónde instalarse.