La mayoría de los informes decepcionantes no lo son por el laboratorio. Es que se preguntó una cosa y se contrató la técnica de otra. Un 16S impecable no te va a decir qué hongo tienes, por bien hecho que esté.
16S: bacterias y arqueas, y nada más
El gen 16S rRNA existe en bacterias y arqueas, y no en hongos ni en plantas ni en nematodos. Se amplifica con cebadores que reconocen regiones conservadas y se lee la parte variable de en medio. Es barato, está estandarizado y tiene detrás las mayores bases de datos de referencia.
Su límite no es la calidad sino el alcance: lo que no tiene el gen, no aparece en el resultado. Un suelo con un problema de Fusarium, de Rhizoctonia o de Pythium puede dar un 16S perfectamente normal, porque ninguno de los tres es una bacteria.
Dentro del propio 16S también importa cuánto gen se lee. Johnson y colaboradores (2019) compararon regiones variables sueltas frente al gen completo y concluyeron que el gen completo mejora la resolución hasta nivel de especie en muchos casos donde una región corta se queda en el género. Callahan y colaboradores (2019) demostraron además que se puede leer el 16S completo con resolución de un solo nucleótido usando lectura larga. Por eso nuestro bacterioma usa 16S V1–V9 y no un fragmento.
ITS: la región para hongos
Para hongos el marcador estándar es el ITS, la región espaciadora interna transcrita. Schoch y colaboradores (2012) la propusieron como código de barras universal para hongos tras compararla con otros marcadores en un trabajo colectivo muy amplio, y desde entonces es la referencia.
Conviene saber que el micobioma es más incómodo de medir que el bacterioma. La revisión de Nilsson y colaboradores (2019) repasa los problemas habituales: sesgo de cebadores, longitud muy variable de la región, y bases de datos de referencia con más huecos y más errores de anotación que las bacterianas. Nada de esto invalida el ITS —es lo mejor que hay—, pero explica por qué una proporción de las lecturas fúngicas se queda sin identificar por debajo del género y por qué conviene leer los porcentajes fúngicos con menos literalidad que los bacterianos.
Shotgun: todo el ADN, a otro precio
La metagenómica shotgun no amplifica un gen: secuencia todo el ADN de la muestra. Quince, Walker, Simpson, Loman y Segata (2017) revisaron el enfoque de principio a fin. Las ventajas son dos: ve a todo el mundo a la vez —bacterias, arqueas, hongos, virus— y da genes funcionales reales en lugar de inferidos.
Los inconvenientes también son dos, y en suelo pesan. El primero es el coste por muestra, que cambia el tamaño del ensayo que te puedes permitir. El segundo es que en suelo agrícola buena parte del ADN es de la planta y de eucariotas grandes, de modo que una fracción del esfuerzo de secuenciación se va en algo que no interesa.
Es la técnica adecuada cuando la pregunta es funcional y el presupuesto permite pocas muestras bien elegidas. No lo es cuando hace falta comparar veinte parcelas.
PCR y qPCR: una pregunta concreta, una respuesta rápida
Las técnicas dirigidas contestan a «¿está este organismo y cuánto hay?». No dan panorámica, pero son sensibles, rápidas y cuantitativas. Martinelli y colaboradores (2015) las sitúan dentro del abanico de métodos de detección de enfermedades vegetales y señalan lo que las hace útiles en campo: el límite de detección bajo y el plazo corto.
La diferencia que importa frente al cribado por secuenciación es que la qPCR da carga, no solo presencia. En sanidad vegetal eso suele ser lo que decide: casi todos los suelos tienen algo de Fusarium; lo que cambia la decisión es cuánto.
Qué técnica para qué pregunta
«¿Cómo está la biología de mi suelo?» → 16S, o 16S + ITS si importan los hongos. Es la base de la comparativa entre parcelas.
«¿Mi bioestimulante hace algo?» → 16S + ITS, tratado contra testigo y en dos tiempos. Lo que se mide es el cambio, no el valor absoluto.
«¿Tengo este patógeno, y cuánto?» → PCR o qPCR dirigida. Resultados en 72 horas.
«¿Qué funciones hay y cuáles se expresan?» → shotgun para el potencial completo, qPCR de genes marcadores o transcriptómica para la actividad.
«¿Hay metanógenos / arqueas?» → 16S, que sí los cubre, a diferencia de lo que mucha gente supone.
Y una combinación que funciona muy bien en sanidad vegetal: cribado amplio por secuenciación para ver el contexto y qPCR dirigida para cuantificar lo que el cribado señale. Primero la foto, después la medida.
Lo que no mide ninguna de ellas
Todas trabajan sobre ADN, y el ADN no distingue entre un organismo activo, uno latente y uno muerto hace poco. Tampoco miden biomasa en gramos: dan abundancias relativas, de modo que un taxón puede «subir» en el informe solo porque otro ha bajado.
Es la misma distinción de siempre: una capacidad documentada no es un flujo. Saberlo antes de encargar el estudio evita la decepción de descubrirlo al leer el informe.
Qué hacemos en AIMA Agro
No vendemos una técnica: elegimos la que contesta a tu pregunta. El microbioma completo cubre bacterias y hongos con 30 fitopatógenos y 49 biomarcadores agronómicos; el bacterioma se queda en bacterias, con 23 y 42; y el panel de patógenos por PCR responde en 72 horas cuando ya sabes qué buscas. Para la capa funcional combinamos la inferencia PICRUSt2 con qPCR de genes marcadores cuando hace falta confirmar actividad.
Esa elección se hace al diseñar el ensayo, no al recibir las muestras. Tienes el detalle en detección de fitopatógenos y en expresión génica.
Referencias
Schoch, C. L., Seifert, K. A., Huhndorf, S., Robert, V., Spouge, J. L., Levesque, C. A., Chen, W., et al. (2012). Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(16), 6241–6246. DOI: 10.1073/pnas.1117018109
Nilsson, R. H., Anslan, S., Bahram, M., Wurzbacher, C., Baldrian, P., & Tedersoo, L. (2019). Mycobiome diversity: high-throughput sequencing and identification of fungi. Nature Reviews Microbiology, 17(2), 95–109. DOI: 10.1038/s41579-018-0116-y
Johnson, J. S., Spakowicz, D. J., Hong, B.-Y., Petersen, L. M., Demkowicz, P., Chen, L., et al. (2019). Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications, 10, 5029. DOI: 10.1038/s41467-019-13036-1
Callahan, B. J., Wong, J., Heiner, C., Oh, S., Theriot, C. M., Gulati, A. S., McGill, S. K., & Dougherty, M. K. (2019). High-throughput amplicon sequencing of the full-length 16S rRNA gene with single-nucleotide resolution. Nucleic Acids Research, 47(18), e103. DOI: 10.1093/nar/gkz569
Quince, C., Walker, A. W., Simpson, J. T., Loman, N. J., & Segata, N. (2017). Shotgun metagenomics, from sampling to analysis. Nature Biotechnology, 35(9), 833–844. DOI: 10.1038/nbt.3935
Martinelli, F., Scalenghe, R., Davino, S., Panno, S., Scuderi, G., Ruisi, P., et al. (2015). Advanced methods of plant disease detection. A review. Agronomy for Sustainable Development, 35(1), 1–25. DOI: 10.1007/s13593-014-0246-1